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行業新聞

RNA抽提- 成功經驗法則大公開!

時間:2020-07-21 11:09:45 來源:本站 點擊:21次

  本期專文要來跟大家討論的話題是核糖核酸(RNA)的萃取,看到這里各位心中可能已經起了疑問:RNA萃取不是很簡單嗎?只要照著標準步驟操作,加一加試劑就完成了,有必要大費周章特地開篇幅來談這件事嗎?其實越簡單的東西遇到困難時就越難解,各位看倌就請耐著性子,聽我們娓娓道來。Lab的經驗和客戶的難題以華聯基因體實驗室的長期以來承接客戶RNA檢體的經驗來說,我們經常遇到的問題是(1)RNA的總量不夠,(2)

  本期專文要來跟大家討論的話題是核糖核酸(RNA)的萃取,看到這里各位心中可能已經起了疑問: RNA 萃取不是很簡單嗎?只要照著標準步驟操作,加一加試劑就完成了,有必要大費周章特地開篇幅來談這件事嗎?其實越簡單的東西遇到困難時就越難解,各位看倌就請耐著性子,聽我們娓娓道來。

  Lab 的經驗和客戶的難題

  以華聯基因體實驗室的長期以來承接客戶RNA檢體的經驗來說,我們經常遇到的問題是(1)RNA的總量不夠,(2)RNA有嚴重的鹽類污染,(3)RNA有嚴重的有機溶劑污染,(4)DNA污染及(5)樣品降解嚴重(圖一圖二)。前四項問題都還好解決,只需要再次萃取或進行純化即可解決,但是樣品降解就較為棘手,常常因重新準備檢體一來一往,耗掉不少心力和時間,最后也拿不到好的結果。

  客戶經常會問為什么執行芯片實驗會如此要求RNA質量呢?而其他的檢測方法如實時定量聚合連鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR) 卻不需要?

  回答這個問題前就要從實驗的原理說起,簡單的講Q-PCR的檢測原理是針對要檢測的基因,設計一對基因特異性的引子,透過反轉錄反應(RT)配合PCR的放大方式和及時偵測放大的產物量,藉以回推原始的RNA含量;而RT的方式主要是采用隨機引子(Random_primer)、進行互補DNA (cDNA)的翻制,因此即便RNA有些微裂解,作為模板的RNA也可以忠實的被翻制成cDNA。但是芯片實驗進行,主要是以放大和訊息RNA(mRNA)完全配對的互補RNA(cRNA) ,再進行雜合反應,此步驟必須利用poly(dT)- T7啟動子序列和訊息RNA的poly(A)結合后,將T7啟動子序列連帶的鑲入反轉錄的cDNA的5端,再經由T7啟動子驅動試管內反轉錄反應,生合成反股的cRNA,再進行后續的芯片雜交的實驗??上攵?,如果RNA有降解嚴重的現象,表示許多mRNA并不能忠實的被放大因此會產生許多偽陰性的結果。至此讀者心中可能就有一個概念了,假設Q-PCR和芯片被應用在瞎子摸象的故事情節中,用Q-PCR的人只要能摸到大象的耳朵就可以說這里有大象,透過計算耳朵的數量就可以計算大象的數量;但是用芯片實驗方法的人,必須先確認所摸到的個體具備大象的完整特征,才能確確實實的說這里有一只大象。這也就說明了為何芯片實驗會如此要求RNA的質量。

  RNA 萃取的方法有哪些?

  除了傳統的純化方法,如 LiCl 沉淀等外,因應RNA研究的龐大需求,目前市面上已有許多琳瑯滿目的RNA萃取套組,供給不同萃取需求目的之研究,而這些產品的設計原理不外乎是利用有機溶劑進行分層萃取如:(1)phenol-chloroform;或利用RNA于酒精中呈現疏水性的特性,進行吸附分離如:(2)吸附性管柱 (Silica column)。一般而言,只要有正確的RNA操作觀念配合正確的步驟,大致上都可以萃取出質量不錯的RNA,但是不同的萃取方法所取得的RNA組成分布會有所不同,因此建議要根據所要分析的對象RNA,選擇正確的萃取方法或套組,例如:如果要研究小RNA的表現就不可選擇以mRNA為萃取對象的方法。此外,內源核醣核酸分解酶(RNase)含量高的樣品,建議使用含phenol-chloroform的裂解液,以增加去除酶活性的能力。以下我就以TRIzol的操作步驟為例,來跟讀者分享RNA萃取步驟中應注意事項及改善萃取RNA值與量的方法。

  器具如何清潔?

  RNA萃取過程中,會面臨的最大的敵人就是RNase,RNase是一個非常頑強的RNA分解酶,它幾乎無所不在,在我們所處的環境中、身體表面甚至細胞內就有內源性的RNase存在。RNase展現活性時不需要輔酶(coenzyme)或輔因子(cofactor),在變性溶液的環境下雖然會失去活性,但是當去除變性物質后,仍然會展現些許活性,甚至在低濃度的SDS溶液中仍具有活性,因此能做到有效杜絕去除RNase的污染則RNA的萃取就成功了一半了。因此在操作前的首要工作就是,將所有器械置于180℃的高溫下干烤6小時或更長時間;或者以 3% H2O2 浸泡30 分鐘以上,再以滅過菌的DEPC水沖洗干凈后,用鋁箔包覆滅菌后使用。在操做萃取時必須于清潔、無粉塵飛揚的環境,如果環境允許的話,最好在生物柜或化學柜中操作。

  樣品如何收集/保存?

  先前我們提及細胞內存在有內源性RNase,且其表現量在不同種類的組織中差異極大。例如腦組織和心臟組織擁有相對低的內源性RNase,但是胸腺組織和胰臟組織則保有約100,000倍于腦組織的內源RNase。因此動物組織等最好都先用液氮冷凍起來,再進行后續的處理,不建議直接丟到-80℃冰箱。因為急速冷凍可凍結RNase的活性,但-80℃冷凍算是緩慢降溫,仍會造成部分RNA的降解;如果無法快速冷凍檢體,也可以采用市售的檢體保存液,亦可達到不錯的效果。

  如何進行樣品的破碎及均質化?

  有關樣品的破碎和均質化,這個步驟的重點應該擺在如何讓有機裂解液快速浸潤檢體,phenol-chloroform可以溶解細胞,連帶的會造成蛋白變性,因此內源性RNase的活性就會去活化;相反的如果無法讓細胞快速裂解使蛋白裸露進而變性,則RNase就會降解RNA,因此如何使不同組織細胞快速裂解,就是一個值得思考調整的課題,也是左右成敗的關鍵。就檢體類型來說,一般培養細胞多為單層細胞不會遇到這樣的問題,萃取較為容易,但是立體的組織進行萃取就會遇到均質化不均的問題進而造成RNA降解。因此低溫的液氮碾磨就是破碎組織最有效的辦法,但是液氮碾磨較為麻煩,如果遇到樣品數比較多的時候耗時費功效力不彰,但如果條件允許的話,這仍然是一個好方法。但考慮效率和速度,均質機就是一個更好的選擇,但是使用均質機的過程有幾個重點必須注意:(1)速度要快,在RNase展現活性前完成細胞均質化,(2) 避免產熱,以免降解 RNA,(3)不要過度研磨,過度研磨會打斷DNA,造成小片段的DNA污染。此外,在均質裂解細胞的過程中有一個常被會忽略的重點,就是一般細胞和有機裂解液的比例常被忽略,有些操作者會認為多放一些組織就可以得到大量的RNA,但是沒意識到太多的組織和太少的裂解液,造成細胞無法完全被裂解,RNase無法完全被變性,效果反而適得其反,最后RNA嚴重降解。因此如果反應完后均質液太過粘稠無法分層,就必須再加入裂解液。

  樣品的離心分層

  在phenol-chloroform的萃取方式中,混合液的離心轉數不可任意調整,應固定于12000g的轉數,以免因沉降系數改變造成無法有效分層。當離心完成后可以明顯觀察到檢體分成上面水層及下面有機層,而我們要的RNA就溶解在上面水層中,體積約有500~600μl左右。此時建議用小口徑的 100 或 200μl tip將水溶液分段吸取到干凈的1.5ml的離心管中,而在這個步驟常見的失誤就是:操作的人急于將水層取出而攪動原先的分層;或感覺萃取不易想要多回收一些RNA,于是將水層盡其可能的取出,因而造成吸取到有機溶液和大量的DNA污染(圖三),造成后續實驗處理上的困擾甚至實驗失敗,因此強烈建議只萃取7~8成的RNA水溶液進行下一個步驟,俗話說的好,所謂有失必有得,不必為了一顆樹而放棄整片森林,適時的取舍可以確保后續實驗順利進行。此外一般來說,phenol與水有一定比例的互溶,所以此時的RNA水溶液中仍有一定的phenol殘留,建議一定要再使用chloroform進行一次離心分層去除殘存phenol。

  RNA 樣品的沉淀

  一般我們會使用乙醇(水溶液:乙醇=1:2.5)或異丙醇(水溶液:異丙醇=1:1)進行RNA沉淀,在效果上并無明顯差異,但是如果已知RNA的含量是少的,則可以使用乙醇沉淀法,并將檢體置于-80℃冰箱間隔一個晚上再做離心的動作,并配合離心時間的增加,如此可增加RNA沉淀的回收率。

  RNA 樣品的清洗去除鹽類

  為了去除RNA沉淀物中的鹽類,我們可以采用70~75%乙醇進行洗滌,可能的話盡量讓核酸沉淀懸浮起來,最好的是使用兩次洗滌,再將離心管放入離心機中離心,用移液器將殘留的乙醇小心吸掉,稍微抽干或吹干核酸沉淀物使殘存的乙醇揮發后,再以DEPC水進行回溶。

  結語

  如果以上所闡訴的部分您都注意到了也改善了,但是仍然不能萃取出好質量的RNA,那或許我們就必須檢視我們的實驗設計是否會導致RNA降解機制的活化,例如:細胞正在經歷細胞凋亡或組織壞死的生理反應;或者處理的藥物會直接引起RNA降解等,如果是那可能就要作實驗設計修正或下修對RNA質量的要求。


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